Meningkatnya kebutuhan transportasi turut meningkatkan konsumsi bahan bakar sehingga menyebabkan kelangkaan. 10 tahun terakhir Indonesia mengalami penurunan produksi migas sehingga diperlukan energi alternatif seperti bioetanol. Masyarakat sering menyisakan limbah nasi yang mengandung karbohidrat dan bisa diubah menjadi alkohol. Penelitian ini bertujuan mengetahui perbandingan volume air, berat ragi dan waktu fermentasi untuk menghasilkan kadar bioetanol optimal serta pengujian karakteristik bioetanol. Penelitian ini menggunakan metode eksperimen dengan berat nasi basi 250 gram, volume air (750,1000,1250, 1500 ml), berat ragi (5, 7, 9, 11 gram) dan waktu fermentasi (3,4,5,6 hari) hingga diperoleh kadar bioetanol maksimal. Pembuatan bioetanol dilakukan dengan tahap sakarifikasi, fermentasi dengan saccharomyces cerevisiae serta distilasi suhu 78ºC. Setelah diperoleh kadar >95%, dilakukan pengujian karakteristik sesuai Keputusan Dirjend Energi Baru, Terbarukan dan Konservasi Energi Nomor 722K/10/DJE/2013. Data pengujian disajikan dalam bentuk tabel dan grafik disertai penjelasan secara distributif. Hasil penelitian menunjukkan bahwa perbandingan terbaik yaitu volume air 5000 ml, berat ragi 45 gram dan waktu fermentasi 5 hari dengan kadar bioetanol 29%. Selanjutnya dilakukan distilasi bertingkat untuk mencapai kadar 96,5% dengan penambahan silica gel 25 gram dan batu kapur 30 gram pada ujung kondensor sebagai penyerap kadar air. Hasil karakteristik bioetanol limbah nasi basi yaitu kadar bioetanol 96,5%, kadar metanol 0,00103%-v, kadar air 0,7726%-v, kadar tembaga 0,0067 mg/kg, keasaman sebagai asam asetat 2 mg/L, tampakan jernih, tidak ada endapan, kadar ion klorida 0 mg/L, kandungan belerang 50 mg/L, kadar getah 1,2 mg/100ml, nilai kalor 5724 kkal/kg, titik nyala 30°C, titik beku -50°C, densitas 0,808 gr/cm3, viskositas 3,5 cPs dan pH 7,55. Terdapat beberapa karakteristik yang melebihi standar Dirjen Energi Baru, Terbarukan dan Konservasi Energi Nomor 722K/10/DJE/2013 yaitu kadar belerang dan kadar air yang diduga karena pada alat distilasi mengandung berbagai unsur paduan logam serta bahan baku yang sudah mengandung kadar air tinggi yaitu 57%. Secara perhitungan ekonomis bioetanol limbah nasi basi lebih mahal dari pada bioetanol di pasaran karena proses pembuatannya masih skala kecil.
 
Kata Kunci: Bioetanol, saccharomyces cerevisiae, sakarifikasi, fermentasi, distilasi.