Latar belakang. Staphylococcus aureus adalah salah satu bakteri gram positif berbentuk kokus dan merupakan bakteri patogen bagi manusia. Staphylococcus aureus termasuk bakteri yang banyak resisten terhadap antibiotik. Penelitian zat yang berkhasiat sebagai antibakteri perlu dilakukan untuk menemukan senyawa antibakteri baru yang berpotensi untuk menghambat atau membunuh bakteri yang resisten terhadap antibiotik. Pisang ambon (Musa paradisiaca) memiliki kandungan senyawa yang berpotensi sebagai antibakteri, sehingga penelitian ini berusaha membuktikkan aktivitas antibakteri yang terkandung didalam tanaman tersebut. Tujuan. Mengetahui kandungan metabolit sekunder, menguji aktivitas antibakteri dan mengetahui konsentrasi efektif ekstrak pelepah pisang ambon dengan menilai diameter zona hambat yang terbentuk. Metodologi. Penelitian ini adalah penelitian eksperimental laboratorium dengan desain penelitian Rancangan Acak Lengkap (RAL). Skrining fitokimia dilakukan dengan metode tabung. Uji aktivitas antibakteri dengan metode Disc Diffusion Kirby Bauer terhadap Staphylococcus aureus. Konsentrasi ekstrak pelepah pisang ambon yang digunakan terdiri dari konsentrasi 7,5%; 15%; 30%; 60%. Kontrol yang digunakan adalah levofloxacin (kontrol positif) dan Tween 20 10% (kontrol negatif). Hasil. Skrining fitokimia menunjukkan ekstrak pelepah pisang ambon mengandung alkaloid, fenol, flavonoid, saponin, tanin dan steroid. Pengaruh pemberian ekstrak etil asetat pelepah pisang ambon terhadap Staphylococcus aureus ditandai dengan terbentuknya zona hambat pada semua konsentrasi secara berurutan dengan rerata diameter sebesar 8,74 mm; 11,57 mm; 9,83 mm; 9,58 mm. Kesimpulan. Ekstrak etil asetat pelepah pisang ambon memiliki aktivitas antibakteri terhadap Staphylococcus aureus dengan konsentrasi efektif adalah 15%.