Salah satu upaya peningkatan nilai ekonomi limbah tulang ikan adalah mengolahnya menjadi gelatin. Ikan kembung merupakan ikan yang relatif murah, digemari masyarakat dan mengandung protein tinggi. Untuk menghasilkan gelatin berkualitas baik diperlukan optimasi pengolahan diantaranya yaitu variasi konsentrasi dan jenis larutan asam serta waktu ekstraksi. Tujuan penelitian ini adalah mencari perlakuan asam terbaik pada proses demineralisasi dan waktu terbaik pada proses ekstraksi dengan aquades menggunakan two-ways ANOVA, serta menguji sifat fisikokimia gelatin dari rendemen tertinggi. Pelarut asam yang digunakan adalah asam klorida (HCl), asam sulfat (H2SO4), dan asam asetat (CH3COOH) dengan konsentrasi masing-masing 2, 4 dan 6% v/v. Variasi waktu ekstraksi yaitu 2, 4 dan 6 jam. Hasil penelitian menunjukkan bahwa rendemen tertinggi diperoleh dari perendaman dengan H2SO4 4% dengan waktu ekstraksi selama 6 jam yaitu 4,27%. Gelatin tersebut memiliki sifat fisikokimia: pH 4,0, titik leleh 28-31,2 oC, titik isoelektrik 9,0, viskositas 2,8 cPs, bobot molekul relatif sebesar 38.390,9 g/mol, kadar air 9,30%, kadar abu 23,85%, kadar protein 58,37%, kadar lemak 0,86% dan kadar karbohidrat 7,63%. Analisis FTIR dari gelatin yang dihasilkan menunjukkan gugus-gugus fungsi O-H, C-H, C-N, C=O, dan N-H yang sama dengan gelatin komersial. Namun, masih diperlukan optimasi seperti suhu ekstraksi agar gelatin hasil isolasi memenuhi standar mutu.